1. Översiktlig projektbeskrivning

Engelsk titel

Tolerance and immunomodulation in autoimmune and Staphylococcus aureus induced arthritis

Sammanfattning av projektet

Reumatoid artrit (RA) drabbar ca 1% av befolkningen. Behandlingen har revolutionerats bl a genom s k biologiska läkemedel. Tyvärr botas inte sjukdomen, den kommer tillbaka om behandlingen avslutas. Dessutom är behandling dyr och har biverkningar – ffa infektioner. Det ideala vore att bota sjukdomen genom att omprogrammera immunförsvaret så det slutar attackerar egen vävnad (dvs skapa tolerans), men för att utarbeta en sådan behandling måste vi bättre förstå immunsystemet.

Den vanligaste orsaken till bakteriell infektion i leden är S. aureus som trots antibiotika ger upphov till svår ledförstörelse. Det är därför angeläget även här med bättre behandling.

I. Att undersöka mekanismer som reglerar tolerans vid RA
Vi har satt upp en musmodell av tolerans vid RA genom att använda genterapi riktad mot antigenpresenterande celler (APC). Modellen fungerar som ett verktyg så att vi på djupet kan studera ingående immunologiska mekanismer. Vi har kunnat visa att vi kan förhindra uppkomst av artrit såväl som behandla pågående artrit. Vi studerar:

1.Om någon typ av APC är viktigare än någon annan för att skapa tolerans?
2.Preliminära data talar för att B-celler skulle kunna vara en sådan APC. Men hur bidrar B-cellerna till att skapa tolerans? Finns det undergrupper av B-celler hos mus/människa som antigen leder till sjukdom eller tolerans? Uttrycker de något speciellt protein som kan utgöra ett nytt behandlingsmål?
3.I musmodellen skapas tolerans mot en av huvudbeståndsdelarna i ledens brosk. Är denna tolerans kraftfull nog för att omprogrammera immunförsvaret så att reaktioner även mot andra ledproteiner förhindras?

II. Immunomodulation vid S. aureus artrit.
Vi har visat att blockad av interleukin-15 minskar leddestruktionen vid S. aureus artrit. Vi kombinerar nu blockad av IL-15 med antibiotika för att se om detta tillsammans helt kan förhindra leddestruktion.

Typ av projekt

Forskningsprojekt

MeSH-termer för att beskriva ämnesområdet

Added MeSH terms

Musculoskeletal Diseases

Diseases of the muscles and their associated ligaments and other connective tissue and of the bones and cartilage viewed collectively.

Rheumatic Diseases

Disorders of connective tissue, especially the joints and related structures, characterized by inflammation, degeneration, or metabolic derangement.

Autoimmune Diseases

Disorders that are characterized by the production of antibodies that react with host tissues or immune effector cells that are autoreactive to endogenous peptides.

Arthritis, Rheumatoid

A chronic systemic disease, primarily of the joints, marked by inflammatory changes in the synovial membranes and articular structures, widespread fibrinoid degeneration of the collagen fibers in mesenchymal tissues, and by atrophy and rarefaction of bony structures. Etiology is unknown, but autoimmune mechanisms have been implicated.

Projektets delaktighet i utbildning

Avhandling
D-uppsats / Magisterexamen
C-uppsats / Kandidatexamen
ST-läkarutbildning
Annan utbildning
Ej del i utbildning

2. Projektorganisation och finansiering

Arbetsplatser involverade i projektet

Added workplaces

Landsting - Västra Götalandsregionen - Specialiserad vård - Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Område 4 - Reumatologi

Statligt - Universitet - Göteborgs universitet - Sahlgrenska akademin - Institutionen för medicin, avdelningen för reumatologi och inflammationsforskning [2006 - ]

3. Processen och projektets redovisning

Pågående aktiviteter

Planering och förberedelse före datainsamling
Datainsamling pågår
Analys av insamlade data pågår
Författande av skriftlig redovisning / publikation pågår
En eller flera publikationer från projektet är publicerade
Slutfört och inget mer görs inom ramen för detta projekt

Projektstart (när planeringen påbörjas och börjar dokumenteras skriftligt)

2012-01-01

Datum för påbörjande av datainsamling

2012-03-01

Datum då projektet är slutrapporterat

2015-12-31

Publication

Tillämpning av resultat - tidsaspekt (projektledarens bedömning)

Resultaten kommer sannolikt att tillämpas om >5 år från projektslut.

Tillämpning av resultat - genomslag (projektledarens bedömning)

Internationellt (i flera länder)

Tillämpning av resultat - beskrivning

Projektet avser två delar; tolerans i autoimmun artrit och immunomodulering i septisk artrit.
Vi har nu satt upp ett robust modell-system för tolerans i autoimmunartrit och inte modellen, men väl resultaten, kan komma att ha stor betydelse för en ökad förståelse av immunoregulatoriska mekanismer, vilket i sin tur kan ligga till grund för utveckling av nya behandlingsstrategier vid t ex ledgångsreumatism.
I septisk artrit orsakad av S. aureus att den uttalade ledförstörelsen till stor del beror på cytokinen IL-15. Det är möjligt att en blockad av denna tillsammans med antibiotika kan utgöra en potentiell ny behandlingsform.

4. Detaljerad projektbeskrivning

Bakgrundsbeskrivning

Reumatoid artrit (RA) är en kronisk och destruktiv autoimmun sjukdom som drabbar ca 1% av befolkningen. Dagens behandling betonar behovet av tidig nedreglering av inflammationen för att förhindra permanenta ledskador och remission uppnås hos majoriteten av patienterna, särskilt de med nydebuterad sjukdom. Tyvärr botas inte sjukdomen, den kommer tillbaka om behandlingen (som är dyr och ofta behäftad med biverkningar – ffa infektioner) avslutas. Det bästa vore att bota den autoimmuna sjukdomen genom att omprogrammera immunförsvaret dvs att skapa tolerans. För utveckla en sådan metod måste vi bättre förstå vad som händer i immunsystemet när det omprogrammeras.

Bakteriella ledinfektioner orsakas ofta av S. aureus och medför ofta bestående handikapp pga uttalad destruktion trots antibiotika-behandling. Det finns därför ett behov av att förbättra behandlingen genom att studera om antibiotika i kombination med immunosuppression kan förbättra förloppet.

Syfte

I. Att hitta nya behandlingsstrategier för att bota RA genom att studera de immunologiska mekanismer som genom toleransinduktion förhindrar uppkomst av autoimmun artrit eller som nedreglerar en redan etablerad artritsjukdom både i musmodeller av RA (musRA) och patienter med RA (human RA).

II. Att förbättra behandling vid S. aureus artrit genom att studera hur immunsvaret kan moduleras så att generell morbiditet och leddestruktion förhindras i S. aureus inducerad artrit.

Frågeställning / Hypoteser

Har olika APC-typer olika funktion i antigenspecifik tolerans i musRA?
Leder antigenspecifik tolerans i musRA även till tolerans mot andra proteiner?
Vilka immunologiska mekanismer deltar i generell/antigenspecifik tolerans i musRA?
Eftersom B-celler är viktiga för både artrit och tolerans, kan enskilda karakteristiska B-cellspopulationer identifieras i mus och human RA?
Hur bidrar IL-15 till leddestruktion? Kan S. aureus artrit förbättras genom behandling med antibiotika och blockad av IL-15?

Metod: Gruppindelning

MusRA: Mössen indelas i grupper så att aktiv behandling kan jämföras med adekvata kontroller.

Human RA: Patienter i B-cells studien inkluderas avseende förekomst/frånvaro av antikroppar mot citrullinerade proteiner (anti-CCP), sjukdomsaktivitet och sjukdomsduration samt typ av behandling. Patienterna kommer att jämföras mot varandra eller med sig själva över tid.

Metod: Databearbetning

Vi kommer att använda tidsserieanalys för att identifiera statistiskt signifikanta skillnader före och efter behandling. Trender över tiden kommer att kvantifieras med hjälp av multivariat robust regression. Logistisk multivariat robust regression kommer att användas för kategoriska svarsvariabler. Skillnader mellan separata tidpunkter kommer att analyseras med hjälp av icke-parametriska test (Wilcoxon-Mann-Whitney rank-sum test). Vi kommer även att utföra en korrelationsanalys av de uppmätta kovarianterna för att uppskatta deras samvariation mellan patienterna. All analys kommer att genomföras i det statistiska programmeringsspråket R (version 2.13.0) eller Graph Pad Prism.

Resultat

Aim I. To define the mechanisms that regulate the induction and maintenance of tolerance in autoimmune arthritis
It is well known that tolerance can be induced when the tolerogen is presented in excessive amounts on APCs, especially in the absence of co-stimulatory molecules. We have used this knowledge to construct self-inactivating lentiviral vectors with the tolerogen to mouse RA (collagen type II (CII) amino acids 259-270) inserted in the MHC class II-associated invariant chain (CLIP) position in the invariant chain. Under normal conditions CLIP is exchanged for a peptide with higher affinity to MHC class II and thus presented by the APC. Using gene therapy we now force the expression of the tolerogen on MHC class II, as the CII aa 259-270 have a very high affinity for MHC II in the Abq-restricted mouse strain we use (DBA/1 or B10q mice). Thus, the endogenous loading of the peptide increased and the cell is not simultaneously activated and does not express co-stimulatory molecules.

We have used this lentiviral vector-based gene therapy approach to establish a tolerogenic mouse model of human RA. We have previously demonstrated partial tolerance induction to arthritis in mice injected with tolerogenic lentiviral particles (Gjertsson 2009). Our more recent data showed that arthritis development is abolished completely in mice transplanted with haematopoietic stem cells (HSCs) transduced with tolerogenic lentiviral particles (Eneljung manuscript in preparation). We also showed that the gene therapy exerts a potent antigen-related effect on B cells as the number of CII-specific antibodies, but not the general serum level of antibodies, was reduced We extended this model to investigate the specific effect of T cells in the induction of tolerance: transfer of spleen T cells from a non-immunised mouse that had previously been transplanted with transduced HSCs reduced the severity of arthritis in the recipient, suggesting that tolerance is partially mediated by T cells.

This mouse model can also be used to study tolerance induction as a treatment strategy in manifest arthritis. We can show (Eneljung, submitted manuscript) that intravenous injection of tolerogenic lentiviral particles during the inflammatory phase of mouse RA significantly ameliorates the severity of disease and decreased autoantibody production, which indicates an inhibitory effect on B cells. In addition, we show both increased suppressive function of T-regulatory cells, an increase in natural T-regulatory cells defined as positive in flow cytometry for both CD4, CD25, Foxp3 and Helios.

Aim IA. To clarify whether different types of APCs have different functions in the induction of antigen-specific tolerance in mouse RA
Antigen presenting cells include several different cell types, in particular dendritic cells (DCs), macrophages and B cells. Presently it is not clear if it is more beneficial to target a specific type of APC rather than all types. Here we assess how targeting individual APC types (rather than all APCs) affects tolerance induction.

PRELIMINARY RESULTS
B cells but not macrophages contribute to tolerance to arthritis. Our preliminary data suggest that when the tolerogen (CII) is expressed exclusively on B cells using the Igκ-promoter, the severity of arthritis is significantly suppressed. However, the arthritogenic anti-CII IgG response is similar in both treated and control groups (data not shown) and there is not increased suppression by T regulatory cells (data not shown). In contrast, when the tolerogen is expressed only on macrophages, there is a tendency towards suppression of the arthritis severity, however the data do not reach the level of significance.

These results suggest that the capacity to induce tolerance differs between different types of APCs in our system. B cells seem well suited for tolerance induction while macrophages do not. Further, the immunological mechanisms underlying suppression of arthritis vary depending on if all APCs or only B cells are targeted.

Aim IB. To elucidate the immunological mechanisms involved in general tolerance in mouse RA
As stated above, the disease-driving antigen is often unknown in humans, ruling out the induction of antigen-specific tolerance. An alternative approach is to induce general tolerance. It is known that increased levels of IL-10 reduce the severity of mouse RA, but the tolerogenic mechanisms are not understood. We will study how an inflammation-dependent increase in production of IL-10 affects the outcome of mouse RA and by which immunological mechanisms.

PRELIMINARY RESULTS
Our preliminary data show that gene therapy using the inflammation-dependent promoter giving excessive production of IL-10 significantly reduces the frequency and severity of arthritis compared with controls. In treated mice, flow cytometry analysis revealed that the levels of IL-10 produced by APCs and in particular by B cells were increased in draining lymph nodes, and the serum levels of IL-6 and arthritogenic anti-CII IgG antibodies were decreased while the frequency of T regulatory cells was increased.

Taken together, using the lentiviral system we have established a robust mouse model of antigen-specific and general (IL-10-induced) tolerance to mouse RA, where the contribution of different subsets of APCs including B cells can be studied in considerable detailed. Antigen-specific gene therapy can be used both to prevent development of, and treat a manifest arthritis.

Aim II: To investigate the impact of IL-15 on osteoclastogenesis and joint destruction and as a treatment target in combination with antibiotics in S. aureus-induced arthritis
S. aureus is the most common pathogen which causes septic arthritis in adults. The arthritis is characterised by joint destruction, and 25-70% of affected patients develop permanent joint damage despite adequate antibiotic treatment. The immunological mechanisms underlying the morbidity of S. aureus-induced arthritis have been explored in detail, and it is now clear that the overwhelming host response to infection rather than the presence of the bacteria in the joint is responsible. To date, it has proven difficult to effectively treat this type of infection: on the one hand, a strong immune response is needed to combat the bacteria, but on the other, the same immune response also attacks the joints. Therefore it is important to dampen the immune response to avoid joint destruction while maintaining the host’s ability to clear the bacteria.
Interleukin-15 is one of the mediators of joint destruction in both mouse and human RA, and it plays a role in osteoclastogenesis. We have shown that blockade of IL-15 in mice improves both the outcome of arthritis and bacterial clearance in S. aureus infectio. Importantly anti-IL-15 antibodies have been used in humans for other conditions.

Diskussion

Vårt immunsystem har utvecklats för att skydda oss mot infektioner och måste därför kunna känna igen och reagera mot främmande organismer (t ex virus, svampar och bakterier). Däremot skall inte immunsystemet reagera mot kroppens egna vävnader. Förmågan att negligera de kroppsegna vävnader kallas tolerans och upprätthålls med hjälp av ett intrikat nätverk av immunologiska mekanismer. Bryts toleransen uppstår autoimmuna sjukdomar t ex reumatoid artrit (RA, ledgångsreumatism). I västvärlden drabbas mellan 5 och 8% av någon typ av autoimmuna sjukdom och ungefär 1% drabbas av RA. RA är en kronisk destruktiv ledsjukdom där vi idag betonar vikten av tidig och aggressiv behandling för att förhindra ledskador. På detta sätt når huvuddelen av patienterna remission, i synnerhet de som nyligen fått sin diagnos. Tyvärr så är behandlingen behäftad med biverkningar och upphör behandlingen kommer oftast sjukdomen tillbaka (1). Dessutom kvarstår en betydande sjuklighet även hos välbehandlade patienter, vilket bl a kan mätas i form av ökad mängd sjukskrivningsdagar och ökad sjukpensionering (2). Sjukdomen kan alltså inte i dagsläget botas.

En effektiv och botande behandling mot RA skulle kunna vara att återetablera tolerans mot egen kroppsvävnad. Detta har emellertid varit svårt att åstadkomma både i djurmodeller och hos patienter, vilket i huvudsak beror på att de bakomliggande immunologiska mekanismerna är ofullständigt kända. Det är därför av största vikt att vi ökar vår kunskap inom detta fält.

För att förstå nyckelmekanismer involverade i toleransutveckling har vi etablerat en musmodell av RA där vi kan skapa tolerans (3) och som vi använder i detta projektet. Modellen är extremt reproducerbar och unik i och med att vi med hjälp av genterapi kan studera de enskilda antigen-presenterande cellernas betydelse för toleransuppkomst. Vi har funnit att speciellt B-celler tycks vara mycket betydelsefulla för toleransinduktion och vi kommer att i mycket fokusera våra studier runt denna celltyp. Detta stöds av att man i männsikor (4) och i möss (5) visat att det finns autoreaktiva B-celler samt att terapi riktad mot B-celler hos många RA patienter förbättrar sjukdomen. B-celler kan också vara skyddande, man har t ex funnit en population av regulatoriska B-celler som begränsar utvecklandet av musRA (6). Vi undersöker hur B-cells populationerna förändras både i musRA och i human RA vid sjukdom, hos friska och vid tolerans. Om man kunde behandla en speciell patogen B-cellspopulation skulle man kunna få en behandling som var mer specifik, hade bättre genomslagskraft och färre biverkningar.

Septisk artrit, vilket hos vuxna i de flesta fall orsakas av S. aureus är en snabbt förlöpande infektion som leder till uttalad ledförstörelse. Det är tidigare visat på både mus (7) och barn (8) att antibiotika i kombination med steroider förhindrar ledskada bättre än enbart antibiotika. Steroider har många effekter, bl a ökad infektionskänslighet genom nedreglering av immunförsvaret. Det vore därför bra om man kunde kombinera antibiotikan med något som reducerade ben och brosk destruktion, men inte påverkade värdens förmåga att hantera infektionen i sig. Våra tidigare studier talar för att blockad av IL-15 skulle kunna vara en framkomlig väg (9).

Slutsats

För att kunna förbättra behandling vid autoimmun och septisk artrit behöver de underliggande immunologiska mekanismerna bättre kartläggas. Genom att använda våra djurmodeller av antigen-specifik toleransinduktion och S. aureus artrit har vi goda möjligheter att bidra till detta.

Referenser

1.ten Wolde, S., Breedveld, F.C., Hermans, J., Vandenbroucke, J.P., van de Laar, M.A., Markusse, H.M., Janssen, M., van den Brink, H.R., and Dijkmans, B.A. 1996. Randomised placebo-controlled study of stopping second-line drugs in rheumatoid arthritis. Lancet 347:347-352.
2.Neovius, M., Simard, J.F., Klareskog, L., and Askling, J. 2011. Sick leave and disability pension before and after initiation of antirheumatic therapies in clinical practice. Annals of the rheumatic diseases 70:1407-1414.
3.Gjertsson, I., Laurie, K.L., Devitt, J., Howe, S.J., Thrasher, A.J., Holmdahl, R., and Gustafsson, K. 2009. Tolerance Induction Using Lentiviral Gene Delivery Delays Onset and Severity of Collagen II Arthritis. Mol Ther Apr;17(4):632-640.
4.Meffre, E., Schaefer, A., Wardemann, H., Wilson, P., Davis, E., and Nussenzweig, M.C. 2004. Surrogate light chain expressing human peripheral B cells produce self-reactive antibodies. J Exp Med 199:145-150.
5.Keenan, R.A., De Riva, A., Corleis, B., Hepburn, L., Licence, S., Winkler, T.H., and Martensson, I.L. 2008. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science 321:696-699.
6.Mauri, C., and Blair, P.A. 2010. Regulatory B cells in autoimmunity: developments and controversies. Nature reviews. Rheumatology 6:636-643.
7.Sakiniene, E., Bremell, T., and Tarkowski, A. 1996. Addition of corticosteroids to antibiotic treatment ameliorates the course of experimental Staphylococcus aureus arthritis. Arthritis Rheum 39:1596-1605.
8.Odio, C.M., Ramirez, T., Arias, G., Abdelnour, A., Hidalgo, I., Herrera, M.L., Bolanos, W., Alpizar, J., and Alvarez, P. 2003. Double blind, randomized, placebo-controlled study of dexamethasone therapy for hematogenous septic arthritis in children. The Pediatric infectious disease journal 22:883-888.
9.Henningsson, L., Jirholt, P., Rahpeymai Bogestål, Y., Eneljung, T., Adiels, M., Lerner, U.H., Lindholm, C., Bulfone-Paus, S., McInnes, I.B., and Gjertsson, I. 2011. Interleukin-15 mediates joint destruction in Staphylococcus aureus arthritis. Accepted for publication in Journal of Infectious Diseases.